经典名方黄连汤（ Huanglian Decoction ）出自《伤寒论》（东汉 · 张仲景），被收载于《古代经典名方目录（第一批）》 [1] 。全方由黄连、甘草（炙）、干姜、桂枝（去皮）、人参、半夏（洗）、大枣（擘） 7 味药组成，主治伤寒胸中有热，胃中有邪气，腹中痛，欲呕吐者 [2] 。现代黄连汤及其加减方常用来医治胃肠疾病、妇科疾病及其他疾病，效果非常明显 [3-4] 。 经典名方制剂研发是近年来中药新药研发热点。根据国家药品监督管理局发布《古代经典名方关键信息表（ 25 首方剂）（征求意见稿）》[5] 、 《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》[6] （简称《原则》），制剂研究应以制剂质量与基准样品质量基本一致为目标。但在现代大生产中，中试产品的质量易受提取方式、提取容器等众多因素的影响，难以实现现代提取工艺与传统制法的质量一致性。质量标志物（quality marker ，Q-Marker ）最早于2016 年由刘昌孝院士[7] 提出，通过风险评估、试验设计等手段确定生产的基本工艺的关键质量属性、关键物料属性与关键工艺参数间的关系模型，提高工艺稳健性和产品质量可控性[8-9] 。基准关联度（standard relation ，SR ）可评价现代提取工艺下各样品与基准样品间质量的一致性，进而确定与传统工艺最接近的现代工艺。层次分析法（analytic hierarchy process ，AHP ）- 熵权法可确定各个测定指标的权重系数，将主观赋权法和客观赋权法结合，实现主客观内在统一[10] ，使筛选出的现代提取工艺参数更加科学可信。本研究基于质量源于设计（quality by design ，QbD ）理念，计算不同提取参数的各种评价指标下各样品与基准样品的基准关联度，结合AHP- 熵权法对方中君臣佐使分别主观赋权，确定各评价指标的权重系数，以保证在所筛选的提取工艺参数下制备的样品与基准样品保持质量一致，确保提取工艺稳定可靠，为黄连汤的后续中试工艺和工业化生产提供科学依据。
Waters 2695 型高效液相色谱仪，配备四元泵、柱温箱、自动进样器、2998 检测器、Empower3 色谱工作站，美国Waters 公司；Milli-Q 型超纯水机，美国Millipore 公司；FA1104 型电子分析天平，d ＝0.1 mg ，上海精密科学仪器有限公司；MS105DU 型电子分析天平，d ＝0.01 mg ，瑞士梅特勒- 托利多公司；KQ-500E 型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；AE-1106A 型多功能红外炉，中山市爱米生活电器有限公司。
对照品盐酸小檗碱（批号 11 ，质量分数86.7% ）、盐酸巴马汀（批号11 ，质量分数86.8% ）、盐酸黄连碱（批号11 ，质量分数95.1% ）、甘草苷（批号11 ，质量分数93.1% ）、甘草酸铵（批号11 ，质量分数97.7% ）、6- 姜辣素（批号11 ，质量分数99.9% ）均购自中国食品药品检定研究院。 磷酸二氢钾，色谱级，上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈，色谱级，默克股份两合公司；甲醇，色谱级，江苏汉邦科技有限公司；磷酸，色谱级，上海阿拉丁生化科技有限公司；其他试剂为分析级。 黄连（批号22041211 ）、干姜（批号22041811 ）、水炙甘草（批号22041311 ）、桂枝（批号22041511 ）、人参（批号22041711 ）、汤洗半夏（批号22042011 ）、大枣（批号22041711 ）均由神威药业集团有限公司提供，均经过南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，黄连为毛茛科黄连属植物黄连Coptis chinensis Franch. 的干燥根茎、干姜为姜科姜属植物姜Zingiber officinale Rosc. 的干燥根茎、水炙甘草为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根和根茎、桂枝为樟科樟属植物肉桂Cinnamomum cassia Presl 的干燥嫩枝、人参为五加科人参属植物人参Panax ginseng C. A. Mey. 的干燥根和根茎、汤洗半夏为天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternata Breit. 的干燥块茎、大枣为鼠李科枣属植物枣Ziziphus jujuba Mill. 的干燥成熟果实，均符合《中国药典》2020 年版[11] 饮片标准。
对黄连汤煎煮工艺进行研究，确定最佳工艺：称取黄连 41.40 g ，甘草（水炙）41.40 g ，干姜41.40 g ，桂枝41.40 g ，人参27.60 g ，半夏（汤洗）60.00 g ，大枣42.00 g 于砂锅中，加2000 mL 水，浸泡60 min ，以武火（2200 W ）煮沸后，调节火力至文火（900 W ）保持微沸，煎煮约60 min 后，趁热滤过，滤液放凉后加水调整体积至1200 mL ，即得黄连汤基准样品。
精密量取黄连汤基准样品 10 mL 于恒定质量后的蒸发皿中，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h ，记录质量，计算干膏率。
2.3.2方法学考察 [16] 参考本课题组前期研究基础进行，结果均满足分析要求。
2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取黄连汤基准样品及正交水提液2 mL 置10 mL 量瓶中，加入甲醇7 mL ，再加水至刻度，使甲醇体积分数为70% ，称定质量，超声处理30 min ，放冷，用70% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3.4 指纹图谱的建立及其相似度分析 分别取“2.3.3 ”项下方法制得基准样品供试品溶液及正交水提液供试品溶液，按“2.3.1 ”项下色谱条件进样，测定指纹图谱。将色谱结果以cdf. 的格式导入2012 年版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行评价。以基准样品的指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1 s ，采用中位数法，进行全谱峰匹配，计算相似度。图谱见图1 。
2.4.2方法学考察[17] 参考本课题组前期研究基础进行，结果均满足分析要求。
2.4.4 供试品溶液的制备 同“2.3.3 ”项下供试品溶液的制备方法。
取制得的基准样品，按“ 2.2 ”～“2.4 ”项下方法，平行制备2 份供试品溶液，测定黄连汤基准样品的干膏率及各指标成分含量，算取平均值。
2.6.1 加水量考察 依次称取处方量的饮片于5 L 圆底烧瓶中，分别加入4 、6 、8 、10 、12 倍处方量的去离子水进行回流提取，分别浸泡60 min ，提取60 min 。按“2.3.3 ”项下方法平行制备2 份供试品溶液，测定水提液中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸及干膏率，算取平均值，结果见表1 。随着加水量增加，黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸含量及干膏率呈上涨的趋势，超过10 倍水后，6- 姜辣素含量下降。结合随性物质基准考察指标，加水量的低水平及高水平分别为6 倍量水和10 倍量水。
2.6.2 浸泡时间考察 依次称取处方量的饮片于5 L 圆底烧瓶中，加入8 倍处方量的去离子水进行回流提取，分别浸泡20 、40 、60 、80 min ，提取60 min 。按“2.3.3 ”项下方法平行制备2 份供试品溶液，测定水提液中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸及干膏率，算取平均值，结果见表2 。 随着浸泡时间增加，黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素的含量呈缓慢上涨的趋势，超过 60 min 后，甘草 苷、甘草酸含量略有下降，干膏率无明显变化。因此，浸泡时间的低水平及高水平分别为 20 、60 min 。
2.6.3 提取时间考察 依次称取处方量的饮片于5 L 圆底烧瓶中，加入8 倍处方量的去离子水进行回流提取，浸泡60 min ，分别提取30 、40 、50 、60 min 。按“2.3.3 ”项下方法平行制备2 份供试品溶液，测定水提液中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸及干膏率，算取平均值，结果见表3 。随着提取时间增加，黄连碱、巴马汀、小檗碱的含量和干膏率呈上升趋势，6- 姜辣素的含量无明显趋势，提取时间超过50 min 后，甘草苷上升缓慢且甘草酸含量下降。结合物质基准的各项指标，由此确定提取时间的低水平及高水平分别为30 、60 min 。
（1）关键质量属性（ critical quality attributes ， CQAs ）和关键工艺参数（ critical process parameters ， CPPs ）的确定：基于前期研究，物质基准初步预测黄 连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸、桂皮醛、 6- 姜辣素为黄连汤潜在的质量标志物（ Q-Marker ） [16] 。 由于桂皮醛在制剂中的浓缩、干燥阶段损耗较大，故先提取桂枝挥发油，后用 β- 环糊精进行包合，在制粒环节加入颗粒中。因此，在提取正交试验中，选择 6 个指标成分含量（黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸、 6- 姜辣素）、干膏率及指纹图谱相似度作为黄连汤提取工艺的 CQAs 。结合文献分析，选择料液比（ A ）、浸泡时间（ B ）、提取时间（ C ） 3 个因素作为黄连汤制剂工艺的 CPPs 。
（2）正交试验设计：称取与传统工艺相同处方量的同一批的药材饮片，共 9 份，以料液比（ A ）、浸泡时间（ B ）、提取时间（ C ） 3 个因素为考察对象，以提取物中黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱相似度以及干膏率为评价指标，按 L9(34) 正交表进行提取，检测结果见表 4 。
2.8.1 评价对象 的确定 基准关联度是评价某样品与基准样品的相似度的关键参数，应首先确定样品评价的指标数目 n 和样品数目 m ，本方法的基本路线 所示。本研究将正交试验设计生成的 9 个样品与基准样品相比，以提取物中黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱相似度以及干膏率为评价指标，以 Xi ,j 、 Sj 为评价对象， Xi,j 表示正交试验的第 i （ i ＝ 1 ， 2 ， … ， m ）个样本的第 j （ j ＝ 1 ， 2 ， … ， n ）个指标下的测量值， Sj 表示基准样品的第 j （ j ＝ 1 ， 2 ， … ， n ）个指标下的测量值。
表 Xij 相对于 Sj 的偏差越小，即该条件下制得样品 质量与基准样品相似度更高。根据公式（ 1 ）计算 RDij 。
2.8.3 基准关联度（ standard relation ， SRij ） 的计算 以基准样品质量为标准值（ S ），以正交试验设计下的各样品质量为测得值（ X ），以不同的指标为评价指标，按公式（ 2 ）计算所得结果，称为基准关联度，结果见表 5 。 SRij 表示第 i （ i ＝ 1 ， 2 ， … ， m ）个样本的第 j （ j ＝ 1 ， 2 ， … ， n ）个指标下的基准关联度。 SRij 越接近 100% ，在该指标下的工艺参数制得的样品与基准样品相似度越高。
计算公式如公式（ 2 ）所示，计算根据结果得出，当以黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸为评价指标时，与基准样品最为接近的是试验 8 ；当以 6- 姜辣素为评价指标时，与物质基准最为接近的是试验 9 ；当以指纹图谱相似度为评价指标时，与物质基准最为接近的是试验 6 ；当以干膏率为评价指标时，与物质基准最为接近的是试验 1 。由此可得，当以单一因素为评价指标时，试验所得最优结果会根据评价指标的变化而变化，因此需做综合评分后才能确定提取工艺参数。
（1）构建判断矩阵：根据君臣佐使原则 [12] ，黄 连汤方中黄连和干姜为君药，黄连苦寒，清胸中之热、兼和胃气，干姜辛温，以温胃中之寒；臣药为桂枝和半夏，桂枝辛散温通、祛寒止痛，半夏和胃降逆止呕，宽胸散结消痞；佐药为人参和大枣，兼得益气健脾、缓和药性之效；使药为甘草，甘草甘平，缓腹中之痛 [13] 。诸药合用，可平调寒热、和胃降逆。
本研究参考《中药新药品质衡量准则研究技术指导原则（试行）》要求 [14] ，根据黄连汤的处方组成，结合各味药中指标性成分的实际测得性和稳定能力，选择君药黄连中的黄连碱、巴马汀、小檗碱，君药干姜中的 6- 姜辣素，以及使药甘草中的甘草苷、甘草酸为 6 个指标性成分，同时兼顾干膏率和指纹图谱。通过干膏率反映提取工艺的稳定性，指纹图谱体现制剂过程中小分子成分的轮廓及定性特征。
指纹图谱可反映小分子成分轮廓和定性特质，但与含量测定的指标性成分相比，其所包含的质量信息仍较少 [15] ，故将其重要程度视为与干膏率同等重要。故按黄连碱＝巴马汀 = 小檗碱＞ 6- 姜辣素＞甘草苷＝甘草酸＞指纹图谱相似度≈干膏率的顺序，再根据 AHP 理论判断矩阵 1 ～ 9 标度，对同一层次内 n 个指标的相对重要程度进行打分，结果见表 6 。黄连碱、巴马汀、小檗碱为君药黄连的主要药效成分，相对于 6- 姜辣素较明显重要，故标为 4 ，相对于甘草苷、甘草酸明显重要，故标为 5 ，相对于指纹图谱相似度和干膏率明显更重要，标为 6 ，以此类推，根据公式（ 3 ）构建判断矩阵 A ，数据见表 7 ， 用 aef 表示因素 e 相对于因素 f 的比较结果。
（2）计算主观权重系数（ Wj S ）：首先对判断矩 阵 A 进行几何平均（方根法），按公式（ 4 ）计算得到初始权重系数（ Wj ′ ）， ajn 表示第 j （ j ＝ 1 ， 2 ， … ， n ）个指标因素对第 n （ n ＝ 1 ， 2 ， … ， j ）个指标因素的比较结果，然后按照公式（ 5 ）计算归一化 Wj S ，得到 5 个指标的 Wj S ，结果见表 8 。
（1）建立正交试验原始数据矩阵：现有 m 个样本， n 个评价指标，原始数据矩阵 R ＝ (Xi,j)m ×n ，以黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱相似度及干膏率 8 个指标为评价指标，建立原始数据矩阵（ R ）。
（2）将原始数据转化为概率矩阵：根据公式（ 8 ）将原始数据矩阵 R 转化为概率矩阵（ P ）， Pij 表示在第 j 个指标下第 i 个样本的概率。
2.9.3 综合权重系数（ Wj ）的确定 采用 AHP 得到 Wj S ，熵权法得到 Wj O ，根据公式（ 11 ）计算各指标的 Wj ，结果见表 8 。
通过 AHP- 熵权法得到的 Wj ，可知黄 连碱占比 30% ，巴马汀占比 24% ，小檗碱占比 28% ， 6- 姜辣 素占比 5% ，甘草苷占比 5% ，甘草酸占比 6% ，干膏率占比 2% 。根据公式（ 12 ）计算综合评分，结果见表 4 。由表 4 中结果可知，试验 8 综合评分最高，结果表示与古法最相似的现代工艺参数为 A3B1C2 ，即以 6 倍量的水浸泡 1 h 煎煮 45 min 得到的样品与基准样品的质量最为一致。
对优化后的提取工艺参数做验证，重复试验 3 次，测定黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱相似度及干膏率，计算综合评分，结果见表 9 。验证试验的综合评分均值为 90.11 ，与基准样品质量接近，且符合《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》 [6] 中对制剂生产研究的要求。综合评分的 RSD 值为 1.09% ，说明该方法确定的提取工艺稳定可靠且重复性良好。
黄连汤作为平调寒热、和胃降逆治法的代表方，自古至今一直被众多医家普遍的使用，对其进行经典名方制剂的开发研究意义重大。课题组前期已根据古籍记载制备了黄连汤标准汤液，并建立了其质量 标准 [16-17] 。本研究基于 QbD 理念，选用正交试验设计，建立以黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸、指纹图谱相似度和干膏率为主的质量控制体系，确定以加水倍量、浸泡时间、提取时间作为关键工艺参数，采用单因素实验确定各因素水平，应用正交设计优化经典名方黄连汤的提取工艺。 AHP 作为主观赋权法，由人为确定各个评价指标的权重系数，受人为影响较大；熵权法作为客观赋权法，依据数据变化规律得出最终权重系数，但不能体现中药复方的君臣佐使关系。
本研究结合基准关联度和 AHP- 熵权法对质量评价体系进行赋权，明确 8 个指标在质量控制体系中的权重系数，以此优化黄连汤现代提取工艺为加 6 倍量水、浸泡 60 min 、提取 45 min 。所得工艺可保证工业生产的可行性及产品质量的稳定性，符合经典名方“传承精华、古为今用、古今衔接”的基本研究原则，实现了传统工艺向现代工业生产的关键一步。
来 源：王晓丽，沈哲苑，李丽萍，梅 茜，何天雨，赵晓莉，毛 靖，侯金才，郭 勇，毛春芹，崔恩忠，陆兔林． 基于正交试验结合基准关联度和AHP-熵权法优化经典名方黄连汤提取工艺 [J]. 中草药, 2023, 54(15):4804-4811.
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